白酒和黄酒中生物胺的高效液相色谱分析法（一）-仗马寒蝉网

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黄酒属于酿造酒，白酒酒度一般为15°左右，和黄在世界三大酿造酒（黄酒、酒中葡萄酒和啤酒）中占有重要的生物色谱一席。它是高效以稻米、黍米、液相黑米、分析法玉米、白酒小麦等为原料，和黄经过蒸料，酒中拌以麦曲、生物色谱米曲或酒药，高效进行糖化和发酵酿制而成。液相黄酒含有丰富的分析法营养，有“液体蛋糕”之称，白酒它含有众多生物活性成分，如酚类物质和谷胱甘肽等，能够对人体起到清除自由基，延缓衰老，抑制肿瘤等的生理作用。白酒是中国的国酒，有着2000多年的历史，是一种酒精含量在38%～65%之间的澄清、透明的发酵酒精饮料，通常由高粱或玉米、大米、小麦、豌豆、小米和高粱混合制成。白酒是一种著名的蒸馏酒，其生产工艺不同于其它蒸馏酒，它结合了两种独特的发酵和蒸馏过程，即在发酵过程中，淀粉转化为糖与糖转化为酒精两个过程是同时进行的。白酒中含有丰富的风味成分，包括有机酸、酯、内酯、酚类、杂环、萜类和芳香族化合物。此外，白酒还含有氨基酸和多肽等对人体有益的潜在功能成分。

等对人体有益的潜在功能成分。酒中富含氨基酸，而氨基酸是生物胺的前体物。发酵过程复杂且难以控制，易产生潜在有害物质—生物胺。生物胺（Biogenicamine,BA）是在酒和发酵食品中经常检测到的一类具有生物活性、低分子质量的含氮化合物，对人体有不利影响。氨基酸含量被认为是葡萄酒酿造过程中生物胺形成的主要原因。食品中常见的生物胺主要有：组胺、色胺等杂环胺，酪胺、苯乙胺等芳香族胺，腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等脂肪族胺。其中，组胺和酪胺是食品中对人体影响最大的两种生物胺，分别由组氨酸和酪氨酸脱羧形成。适度摄入生物胺对人体健康起到促进作用，而摄入过量生物胺在人体蓄积会引起许多不适症状，如头疼、呕吐等。过量摄入酪胺还会引起边缘血管收缩，导致机体心律变快、呼吸增强，同时降低体内去甲肾上腺素水平含量。超过100mg会引起偏头痛，超过1080mg会引起严重中毒。组胺的过量摄入会增加肾上腺素和去甲肾上腺素的释放，并刺激运动神经和感觉神经，引起过敏和高血压。组胺是葡萄酒中常见的一种生物胺，不同国家对其限定标准各不相同，其中以德国标准最为严格，规定不得高于2mg/L。欧盟规定食品中组胺含量不得超过100mg/kｇ，酪胺含量不得超过100～800mg/kｇ。目前，酒中生物胺含量的检测方法有多种，如毛细管电泳法（Capillaryelectrophoresis,CE）、高效液相色谱法（Highperformanceliquidchromatography,HPLC）、生物传感器法（Biosensormethod）、薄层色谱法（Thinlayerchromatography，TLC）等。其中HPLＣ法实际应用最为广泛。HPLＣ仪能够同时分析多个目标物，分析速度快且准确性高，因而在生物胺的检测中应用最多。由于生物胺没有共轭特征结构，在紫外检测器上响应较弱，所以对其进行柱前衍生，使其产生紫外和荧光吸收。常用的衍生试剂主要有邻苯二醛（OPA）、丹磺酰氯（Dns-C1）、二硝基苯甲酰氯（DABS-C1）、苯甲酰氯（Benzoylchloride）。丹磺酰氯是最为常用的衍生试剂，其衍生物相对稳定，在避光条件下可稳定存放12～14ｈ。试验中通过丹磺酰氯柱前衍生-HPLC法对黄酒与白酒中生物胺进行检测与比较。

一、材料与方法

1、材料与试剂

山西代县黄酒与内蒙草原王白酒系列均来自于当地企业；9种生物胺标准品（纯度均＞98%）：色胺（CAS号：61-54-1）、β-苯乙胺（CAS号：64-04-0）、腐胺（CAS号：110-60-1）、尸胺（CAS号：462-94-2）、盐酸吡哆胺（CAS号：524-36-7）、组胺（CAS号：51-45-6）、酪胺（CAS号：51-67-2）、亚精胺（CAS号：124-20-9）、精胺（CAS号：71-44-3），上海源叶生物科技有限公司；丹磺酰氯（CAS号：605-65-2），上海麦克林生化科技有限公司；饱和碳酸氢钠、氯化钠、甲酸、正丁醇，西陇化工股份有限公司；乙酸铵，北京迈瑞达科技有限公司；乙腈（色谱纯），赛默飞世尔科技有限公司；丙酮（分析纯）、三氯甲烷（分析纯），北京化工厂；乙醚（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。

2、仪器、设备

LC-20ATHPLC仪，日本岛津公司；MX-Ｆ涡旋振荡器，大龙兴创实验仪器有限公司；UGC24M氮吹仪，北京优晟联合科技有限公司；VELOCITY18R大容量冷冻离心机，澳大利亚Dy-namica公司；实验室pH计，奥豪斯仪器（上海）有限公司；恒温水浴锅，山东甄城华鲁电热仪器有限公司；WaterPro超纯水系统，美国Labconco公司；ME104/02电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；0.22μm滤膜针头滤器，天津市津腾实验设备有限公司。

3、方法

（1）标准溶液的配制

准确称取标准品，以0.1mol/L稀盐酸为溶剂，配制质量浓度为1000mg/L的生物胺单体标准储备溶液。准确量取不同体积的储备液，稀释，配制成终质量浓度分别为50.00，25.00，5.00，1.00，0.50，0.25，0.20，0.10，0.05mg/L的梯度标准溶液。以上所配溶液于4℃冰箱避光存放，保存期为2周。

（2）样品的萃取与衍生

量取酒样10.00mL，向其中加入适量氯化钠至饱和。准确量取上层试样5.00mL，置于15mL离心管中，逐滴加入4～7滴5mol/L氢氧化钠溶液，将溶液pH值调至11.5～12.0范围。加入正丁醇-三氯甲烷（体积比1∶1）混合溶液5.0mL，充分均匀混合后4000ｒ/min离心10min。吸取并保留上层有机相，重复操作两次，合并提取液。取3.0mL提取液，加入0.2mL1mol/L盐酸，充分混合后吸取2mL溶液，在40℃条件下氮气吹干，然后加入1.0mL0.1mol/L盐酸，充分溶解提取物，待衍生。将上述提取液（1mL）置于15mL塑料离心管中，依次加入1mL饱和碳酸氢钠溶液、100μL氢氧化钠溶液（1mol/L）、1mL丹磺酰氯衍生试剂（10mg/mL丙酮为溶剂），涡旋振荡60ｓ后置于60℃水浴环境中衍生，15min后取出，加入100μL谷氨酸钠溶液（50mg/mL饱和碳酸氢钠为溶剂）终止衍生。将上述混合物振荡混匀后，在60℃条件下继续反应15min，取出冷却至室温，向其中加入1mL超纯水，旋涡振荡1min后混匀，置于40℃低温水浴环境下氮吹除去有机溶剂（约1mL），加入0.5ｇ氯化钠，待溶解后继续加入5mL有机溶剂乙醚，振荡2min后静置分层。将上层有机层转移至15mL玻璃试管中，水相（下层）再次萃取。将两次萃取液合并后氮气吹干，加入复溶液乙腈1mL，完全溶解后经0.22μm针头滤器过滤，冷藏待测。

（3）色谱条件

采用赛默飞HGOLDC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）分离，紫外检测波长254ｎm，进样体积20μL，柱温35℃，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液（含0.1%乙酸）-乙腈（9∶1，V/V），流动相B为乙腈-0.01mol/L乙酸铵溶液（9∶1，V/V），流速0.8mL/min。见表1梯度洗脱程序1。